Diagnostyka zakażeń Escherichia coli u świń: typowanie izolatów E. coli

E. coli (EC) – hodowla i serotypy

E. coli jest gram-ujemną bakterią w kształcie pałeczki, która występuje w wielu wariantach. Oprócz naturalnie występujących szczepów flory jelitowej u wszystkich ssaków, klasyfikowane są również szczepy patogenne, zarówno jelit (InPEC) jak i pozajelitowe E. coli (ExPEC). Rozróżnienie tych szczepów jest problematyczne, ponieważ liczne podtypy uniemożliwiają użycie prostych metod fenotypowych.

E. coli można wykryć u świń stosunkowo łatwo. Od zwierząt w ostrej fazie infekcji pobieramy materiał (jelito cienkie, kał) i posiewamy na agar z krwią (Rys. 1) lub na podłoże różnicujące np. Gassner lub MacConkey. Fakt, że niektóre serotypy są często związane z wywoływaniem poszczególnych chorób, w przeszłości wykorzystywano do różnicowania wyizolowanych bakterii (Tabela 1). Dlatego w diagnostyce weterynaryjnej, w celu określenia antygenów O i F, używa się szybkich testów aglutynacji płytkowej, stosując surowice poli- lub monowalentne. (Antygeny "O" są składnikami ścian komórkowych bakterii LPS, czyli endotoksyny; Antygeny "F" [fimbrialne] to adhezyny umożliwiające przyleganie do komórek gospodarza, a następnie do kolonizacji komórek nabłonkowych jelita cienkiego). Jest to metoda szybka, jednak za sprawą reakcji krzyżowych, maskowania antygenów czy też nieprawidłowego rozwoju fimbrii in vitro może prowadzić do błędnych wyników. Z drugiej strony, wzór serologiczny O:K:H jest znanym od dziesięcioleci standardem dla pełnego określenia wszystkich serotypów. Określa nie tylko antygeny "O", ale również antygen "K" (polisacharyd otoczkowy) i "H" (białko rzęskowe).

Tabela 1: Patogeny jelitowe E. coli u świń

E. coli (EC) – patotypy i virotyping

Rozwój biologii molekularnej i postęp w molekularnej analizie biologicznej E.coli doprowadził do identyfikacji wielu genów kodujących czynniki wirulencji (Tabela 2). Z jednej strony, klasyczne szkodliwe w skutkach czynniki wirulencji (toksyn), z drugiej te, które bezpośrednio lub pośrednio ułatwiają kolonizację i przeżycie E. coli w organizmie gospodarza. Identyfikacja tych genów, na przykład metodą PCR, umożliwia określenie potencjału zjadliwości izolatów E. coli i rozróżnienie poszczególnych typów patogenów (Tabela 3). Identyfikacja tych markerów zjadliwości, a tym samym ich genów docelowych nazywa się virotyping.

Tabela 2:Przykłady poszczególnych genów wykrytych w E. coli, oraz czynniki wirulencji (fimbrie, adhezyny, toksyny)

Tabela 3: "Target gens" służące do identyfikacji patotypów E. coli u świń

Jednakże patogenne izolaty E. coli prócz toksyn, zawierają kombinację fimbrii i adhezyn. Wiele toksyn i adhezyn może występować jednocześnie, w różnych kombinacjach. Określenie tych markerów zjadliwości oraz identyfikacja genów zawierających informacje o patotypie E. coli przeprowadza się na bakteriach wyizolowanych z hodowli komórkowej (Tabela 3). Należy podkreślić, że hemolityczne szczepy E. coli nie są jedynymi, które są chorobotwórcze (Rysunek 1). W rzeczywistości nie-hemolityczne E. coli są często określane jako przyczyna objawów klinicznych. Ponadto, hemolityczne szczepy E. coli na ogół nie posiadają odpowiednich genów fimbrialnych i toksyczności. Dlatego też wszystkie warianty izolatów E. coli zidentyfikowane w badaniu, należy w miarę możliwości poddać virotypingowi. Pozwoli to stwierdzić czy wyizolowane i zidentyfikowane szczepy są chorobotwórcze. Informacje określające typ fimbrii i toksyn chorobotwórczych E. coli mogą być również pomocne w doborze odpowiedniej szczepionki zawierającej odpowiednie antygeny.

Fot. 1: Morfologia różnych kolonii patogennych izolatów E.coli na podłożu z dodatkiem krwi (Columbia) zidentyfikowane po virotypingu przez multiplex PCR. Nie tylko hemolityczne E. coli (po prawej) są patogenne.

Przy interpretacji wyników diagnostycznych należy mieć na uwadze, że patotypy E. coli mogą być oczywiście izolowane od zdrowych gospodarzy (infekcja utajona). Ocena wyników diagnostycznych może być przeprowadzona tylko przy uwzględnieniu zarówno stanu klinicznego danego zwierzęcia, jak również stężenia wyizolowanych patogenów.

Interpretacja serotypizacji jest trudna, gdy znaczniki wirulencji są wykrywane bezpośrednio w próbce materiału np. kał, bez wytypowania poszczególnych szczepów. Gdy w próbce są obecne różne patotypy E. coli, uzyskuje się również połączenie wszystkich czynników wykrywalnych, co może prowadzić do identyfikacji fałszywych typów patogenów i kombinacji markerów zjadliwości, które jako takie nie istnieją. Ponadto, jest również możliwe, że w próbce kału wykryjemy markery wirulencji innych bakterii jelitowych. Geny takie, są bardzo do siebie podobne, więc znaczniki wirulencji E. coli mogą zostać pozornie wykryte - w rzeczywistości nie są to czynniki wirulencji E. coli. Dlatego należy szczególnie zwrócić na to uwagę przy interpretacji wyników próbek.

Połączenie badania klinicznego i często niezbędnego badania histopatologicznego (opisane szczegółowo w innym miejscu) oraz odpowiedniego rozpoznania różnicowego w połączeniu z virotyping izolatów E. coli przynosi wyraźną poprawę w diagnostyce zakażeń E. coli u świń.