Możliwości diagnostyki PCVAD

Występowanie i znaczenie zakażeń cirkowirusem typ 2 (PCV2) oraz choroby przez niego wywoływanej (PCVAD, wcześniej PMWS) uległo znacznej zmianie w ostatnich 15-20 latach. Przed rokiem 2004 PCV2 występował powszechnie w populacji świń lecz zakażenia, które wywoływał były bezobjawowe, chociaż należy pamiętać, że nie badania diagnostyczne nie były powszechnie stosowane. Opracowanie definicji choroby i kryteriów diagnostycznych rozpoznawania PMWS (czy PCVAD) przez Sordena w 2000 roku (ryc. 1) uzyskało szeroką akceptację na świecie. Sorden w swojej definicji zawarł opis kryteriów klinicznych i typowych zmian i sekcyjnych i mikroskopowych.

Ryc 1: Definicja PMWS. Sorden, Swine Health Prod 8(3):133-136, 2000

Postawienie ropoznania u świni lub grupy świń wymaga:

W czasie kiedy PCVAD przybrała formę epidemii (2004-2007), straty związane z chorobą i warchlaków i tuczników sięgały niekiedy 40% co doprowadziło w USA zmniejszenia liczby ubijanych świń o prawie 10%. Na początku 2006 roku producenci poszukiwali skutecznych narzędzi walki z PCVAD. Mimo, że wiele grup naukowców miało dobre wyniki w opracowywaniu nowych szczepionek w końcu lat 1990-tych, pierwsza komercyjna szczepionka pojawiła się w 2006 roku a stosowanie szczepień upowszechniło się w latach 2007-2008. Szczepionki przeciw PCV2 okazały się niezwykle skuteczne, zarówno w zapobieganiu stratom związanym ze śmiertelnością i wyniszczeniem, jak i powodując ogólnie lepsze i wyrównane przyrosty. Efekty działania skutecznej immunoprofilaktyki przy pomocy szczepionek w zwalczaniu strat obserwowane są do dziś. Trendy w diagnostyce PCVAD zilustrowany na rycinie 2.

Ryc. 2: Częstość wykrywania PCVAD (ISU VDL)

Obecnie skuteczność szczepionek przeciw PCVAD jest niepodważalna i niemal wszystkie świnie produkowane w USA są szczepione. Ponieważ jednak PCV2 stale utrzymuje się szczepionych populacjach niekiedy dochodzi do występowania PCVAD.

Narzędzia diagnostyczne a zmienność PCV2

Testy diagnostyczne to narzędzia dla doświadczonych w interpretacji użytkowników, wykorzystywane w określonym kontekście klinicznym. Prawidłowe wykorzystanie tych narzędzi jest możliwe jedynie w sytuacji ich zastosowania w połączeniu z innymi elementami procesu rozpoznawczego. Obserwacje czy wyniki badań, które „nie mają sensu” powinny prowadzić do głębokiej analizy procesu diagnostycznego i ewentualnie dalszych badań (ryc. 3). Jest to w teorii proste ale w praktyce często pomijane. Przypuszczenia, nastawienie na spodziewany wynik, powierzchowna analiza może prowadzić do błędnych wniosków diagnostycznych.

Ryc. 3: Proces diagnoistyczny: wszystkie obserwacje powinny układać się w logiczną całość

W diagnostyce PCVAD niezbędne są następujące narzędzia:

1. Badanie mikroskopowe połączone z wykrywnaniem antygenu w tkance (immunohistochemia, hybrydyzacja in situ) i

2. Wykrywanie materiału genetycznego (PCR) i jego analiza (sekwencjonowanie)

Immunohistochemia (IHC) jest doskonałą metodą wykrywania antygenu wirusowego w obrębie zmian mikroskopowych. Niestety IHC jest metodą niezbyt czułą a interpretacja jej wyników jest subiektywna. Często jest stosowanie prowadzi do rozbieżnych wyników. Metoda ta powinna być wykorzystywana przez doświadczonych patologów a jeśli jej wyniki nie przystają do pozostałych elementów w rozpoznaniu, powinno się przeanalizować przebieg badania pod kątem dokładności wykonania.

Barwienie antygenu PCV2 (kolor brązowy) w tkance płucnej świni z obrzękiem iśródmiąższowym zapaleniem płuc metodą immunohistochemiczną.

Reakcja polimeryzacji łańcuchowej (PCR) niewątpliwie jest najczulszą metodą wykrywania genów drobnoustrojów. Dodatni wynik PCR w kierunku PCV2 NIE jest potwierdzeniem, że wirus ten wywołał chorobę w określonym przypadku – jest jedynie odpowiedzią na pytanie „czy w badanej próbce znajduje się PCV2?”. Metody PCR ilościowe czy semi-ilościowe (czyli pozwalające na określenie ilości drobnoustroju w próbce) do wykrywania PCV2 w surowicy świń są często używane do określania poziomu wiremii. Powiązanie poziomu wiremii lub zawartości PCV2 w próbce tkanki z obrazem klinicznym ma solidne podstawy naukowe. Po infekcji PCV2 świnie, które produkują przeciwciała neutralizujące wirus, nie mają objawów klinicznych a wiremia jest zwalczana po 3 tygodniach. U takich świń poziom wiremii nie przekracza 10⁷ kopii wirusa na militr, a czasem jest niższy. Świnie, u których doszło do wystąpienia objawów klinicznych, mają wyższy poziom wiremii, która poza tym trwa dłużej. Wyniki takich badań będą się różniły między laboratoriami, dlatego też lekarze weterynarii powinni o tym pamiętać przy interpretacji wyników uzyskanych z różnych źródeł.

Jednym z ograniczeń PCRjest możliwy brak kompatybilności primerów i sond z genami pewnych szczepów drobnoustrojów. Ostatnio wykryto nowy „mutant” genotypu PCV2b (nazywany mPCV2b lub PCV2d), który został wyizolowany w fermie świń, gdzie opisano „nieskuteczność szczepienia” przeciw PCV2. PCR rutynowo wykorzystywany do różnicowania PCV2a/b w laboratorium diagnostycznym Iowa State University nie wykrył nowego szczepu w badanej próbce, podczas gdy inny test oparty na wykrywaniu fragmentu ORF1 dał wynik dodatni. Metoda IHC dała również wynik dodatni w kierunku PCV2 (Opriessnig). To, że sondy i primery PCR muszą być ciągle doskonalone i uaktualniane, jest powszechnie wiadome, szczególnie w odniesieniu do takich patogenów jak PRRSV. Wyniki badań, które wydają się nie mieć sensu w aspekcie obserwowanych objawów czy zjawisk, zawsze powinny zostać poddane powtórnej analizie. Bez szczegółowych informacji od lekarzy weterynarii o problemach tego typu, laboratoria nie mogą doskonalić swoich metod. Wpływ zmienności szczepów PCV2 na wyniki badań serologicznych wymaga dalszych badań.

Wykrywanie przeciwciał dla PCV2 jest zwykle wykonywane testami ELISA lub seroneutralizacji. Ze względu powszechne występowanie zakażeń PCV2, znaczenie badań serologicznych jest ograniczone a ich wyniki powinny być interpretowane bardzo ostrożnie. Profile serologiczne stad mogą być pomocne w określaniu kiedy dochodzi do infekcji, oraz do oceny potencjalnego wpływu przeciwciał siarowych na określanie terminu szczepień.

Diagnostyka a określanie wpływu na stado

Rozpoznanie roli PCV2 w przypadku chorej świni pozostaje dziś takie samo jak opisał to Sorden 14 lat temu. Stwierdzenie pojedynczych świń z PCVAD w dużej populacji nie jest czymś wyjątkowym ponieważ poprawność immunizacji rzadko wynosi 100%. Automatyczne przypisywanie wirusowi PCV2 zmienności przyrostów, zachorowalności i śmiertelności w populacji, na podstawie takich obserwacji u kilku osobników byłoby niewłaściwe w przypadku obecności patogenów endemicznych (bakterie, wirusy, pasożyty) lub innych czynników wpływających na zdrowie świń (np. żywienie, zarządzanie, środowisko). Odpowiedź na pytanie „Jak ocenić rolę PCVAD w szczepionej populacji?” jest bardzo trudna.

Dokładna diagnostyka wymaga przemyślanego i systematycznego monitoringu świń w dłuższym okresie czasu. Często jednoczesny monitoring innych endemicznych drobnoustrojów (np. Mycoplasma, PRRSV, grypa, Actinobacillus, Haemophilus, Lawsonia, Brachyspira, Salmonella, pasożyty, i inne) jest bardziej obiektywny i przynosi więcej odpowiedzi niż skupianie się wyłącznie na wykrywaniu PCV2. Prawdopodobnie najlepszym sposobem diagnostyki jest systematyczne prowadzenie badań sekcyjnych i rejestracja przyczyny śmierci wszystkich warchlaków i tuczników. Tkanki mogą być umieszczane w formalinie dla ewentualnej dalszej analizy w przypadku trudnego rozpoznania, lub jeśli ktoś chce wykluczyć udział PCV2. Często, enzootyczne zapalenie płuc, zapalenie jelit czy przewlekłe zapalenie błon surowiczych, są stwierdzane jako główne przyczyny strat. Bardzo pomocne może być również prowadzenie regularnego badania poubojowego. Profile serologiczne mogą pomóc w identyfikacji wieku w jakim dochodzi do zakażenia różnymi drobnoustrojami. Wszystkie te działania mogą być uszeregowane pod kątem istotności wpływu na obserwowane straty. Niestety, jak dotychczas nie zostały opracowane wystarczająco precyzyjne procedury do określania wpływu PCVAD lub subklinicznych zakażeń PCV2 na produkcję.