Podejście 3-D do lepszego zrozumienia grypy świń: diagnostyka (1/3)

Zakażenia wirusem grypy typu A (IAV) stanowią poważne wyzwanie w badaniach i praktyce na całym świecie, nie tylko u loch, ale także u prosiąt i tuczników. Wirusy grypy są obecnie endemiczne na wielu fermach trzody chlewnej. Obraz kliniczny jest bardzo zróżnicowany. Diagnoza jest często skomplikowana z powodu współzakażenia i w wielu przypadkach do zidentyfikowania wirusa grypy zaangażowanego w proces chorobowy wymagane jest wykrywanie patogenów poza klinicznie dotkniętymi grupami wiekowymi. Rosnąca dynamika ewolucji genetycznej wirusów grypy oraz zmienność zakaźności i ekspresji choroby wymagają doświadczenia i wiedzy do interpretacji wyników diagnostycznych. W tej pierwszej części cyklu trzech artykułów skupiamy się na najnowszych doniesieniach dotyczących wirusa i podejścia diagnostycznego. Druga część zawiera szczegóły dotyczące choroby klinicznej i współzakażenia, a trzecia zawiera przegląd strategii kontroli.

Wirusy grypy A (IAV) u świń są otoczkowymi wirusami RNA należącymi do rodziny Orthomyxoviridae. Cechą charakterystyczną jest genom składający się z ośmiu segmentów genowych, z których każdy koduje co najmniej jedno białko. Dwa segmenty spośród ośmiu odpowiadają za powierzchniowe struktury antygenowe: hemaglutyninę (HA) i neuraminidazę (NA) (ryc. 1). W zależności od tych struktur IAV są klasyfikowane w podtypach. Dotychczas zidentyfikowano osiemnaście podtypów HA i jedenaście NA.

Do 2009 roku istniały głównie trzy podtypy wirusa grypy A krążące u świń (swIAV), H1avN1, H1huN2 i H3huN2. W tym momencie zidentyfikowano tylko kilka różnych genotypów, które są określane przez wszystkie segmenty genomu. Ten scenariusz zmienił się wraz z wprowadzeniem pandemicznego szczepu H1pdmN1pdm podczas pandemii grypy w 2009 roku. Ostatnio opublikowane dane (Henritzi et al. 2020) pokazują, że obecnie w Europie krąży 31 różnych genotypów swIAV będących wynikiem reasortacji wszystkich ośmiu segmentów genomu między H1pdmN1pdm a starszymi liniami swIAV. Ten pasywny nadzór został przeprowadzony w 2,457 gospodarstwach w siedemnastu krajach europejskich w latach 2015-2017. Wykazał on, że swIAV może być wykrywany w gospodarstwach przez cały rok, a zatem nie jest sezonowy, w przeciwieństwie do ludzkiej grypy. Stwierdzono różnice w rozmieszczeniu podtypów w poszczególnych regionach.

Do bezpośredniego wykrywania swIAV dostępnych jest wiele metod diagnostycznych. Metody i liczba próbek powinny być dobrane w zależności od sytuacji w stadzie. Wymazy z nosa nadają się do PCR w kierunku grypy typu A. W przypadku wyniku dodatniego i odpowiedniej ilości wirusa, za pomocą RT-PCR można przeprowadzić typowanie dla HA i NA. Należy zauważyć, że zwierzęta wydalają zakaźnego wirusa zazwyczaj tylko przez pięć do siedmiu dni po zakażeniu, a eliminują go z płuc po około dziewięciu dniach. Z tego względu istotne znaczenie ma punkt czasowy pobierania próbek poszczególnymi metodami (wymazy z nosa, popłuczyny oskrzelowo-pęcherzykowe, płuca). Ponieważ obraz kliniczny jest często powikłany wtórnymi infekcjami, swIAV może nie być już wykrywalny w momencie wystąpienia najcięższych objawów. W przypadku zakażeń wieloma podtypami wirusa swIAV, nie wszystkie występujące podtypy mogą być równie dobrze wykryte. Szczególnie w gospodarstwach z endemiczną grypą i niejasnymi objawami klinicznymi zaleca się stosowanie metod przesiewowych (próbki wymazu z wymienia, próbki płynu ustnego) w różnych grupach wiekowych.

Jeżeli pięć wymazów z nosa w próbce zbiorczej jest badanych wspólnie metodą PCR, nie ma praktycznie żadnej utraty czułości. Wskaźnik wykrywalności może zostać zwiększony, ponieważ przy użyciu puli można przetworzyć więcej próbek przy niższym koszcie. Wymaz z nosa pozostaje zatem kluczowy dla diagnostyki grypy. Dobra jakość próbki często pozwala na jej typowanie i hodowlę. Ważne jest, aby próbki były wysyłane do laboratorium schłodzone, przesyłką ekspresową. W ognisku choroby o ostrym przebiegu klinicznym próbki powinny być pobierane od zwierząt z gorączką, u których choroba zaczęła się niedawno rozwijać. W stadach zakażonych endemicznie wybór zwierząt do pobierania próbek powinien być dostosowany do faktu, że zwierzęta z typowymi objawami, takimi jak wysoka temperatura, są mniej widoczne. Wykrycie wirusa jest często możliwe we wczesnym stadium u prosiąt ssących, bez widocznych objawów klinicznych. Ponieważ przeciwciała matczyne chronią prosięta ssące przed chorobą, a nie przed zakażeniem, prosięta ssące mogą być nosicielami wirusa i przenosić go do odchowalni. Ze względu na to, że mieszanie prosiąt umożliwia bardzo szybkie rozprzestrzenianie się wirusa, okres krótko po odsadzeniu jest dobrym momentem na pobieranie prób. Należy również pobrać próbki od zwierząt z grup wiekowych, które regularnie wykazują objawy kliniczne (kichanie, wypływ z nosa, kaszel, gorączka, nagłe opadanie z sił). Korzystne jest zatem badanie przekrojowe, polegające na pobieraniu próbek z różnych grup wiekowych w tym samym czasie, aby uzyskać najlepszy przegląd krążących w gospodarstwie szczepów SwIAV.

Jako metoda pośrednia (wykrywanie przeciwciał), "test hamowania hemaglutynacji (HI)" na próbkach surowicy od najlepiej nieszczepionych zwierząt może wskazać inne podtypy, które nie zostały wcześniej bezpośrednio wykryte. Test HI opiera się na fakcie, że efekt krzepnięcia krwi powodowany przez IAV jest hamowany przez przeciwciała. Jeśli surowica świni może zapobiec krzepnięciu krwi przez szczepy wirusa grypy używane w teście, jest to wskazanie, że świnia wytworzyła specyficzne przeciwciała przeciwko podobnym podtypom. Dlatego też test HI ma przewagę nad testem ELISA, który może dostarczyć jedynie informacji na temat grypy A w ujęciu ogólnym. Jednakże próbki surowicy od prosiąt aż do końca okresu przebywania w odchowalni często nie wykazują przeciwciał, nawet jeśli zwierzęta miały kontakt z wirusem grypy A w odchowalni. Serokonwersji mogą zapobiec przeciwciała pochodzące od matki, przekazywane prosiętom nie tylko przez zaszczepione, ale również przez wcześniej zakażone lochy. Dlatego też nie jest rozstrzygające pobieranie próbek krwi od prosiąt w odchowalni, jednak sparowane próbki surowicy od tuczników lub loszek mogą być bardziej przydatne.

Chociaż diagnostyka jest często bardzo pracochłonna, jest ona jedynym sposobem na określenie szczepów krążących w gospodarstwie i czasu zakażenia. Jest to warunek konieczny do wdrożenia właściwych środków zarządzania i protokołów szczepień.