Praktyczne wskazówki dotyczące pobierania płynów ustnych

Niedawne pandemie (COVID-19 u ludzi, afrykański pomór świń u świń) pokazały, że systematyczne gromadzenie danych dotyczących zdrowia populacji jest potrzebne, aby zrozumieć sytuację i pokierować skuteczną reakcją. Zbieranie danych dotyczących zdrowia populacji świń było problematyczne, ponieważ objawy kliniczne są bardzo zmienne, a pobieranie próbek / badanie indywidualnych zwierząt jest kosztowne. Z drugiej strony, nadzór w oparciu o płyn ustny jest łatwy, dokładny i opłacalny.

Płyny z jamy ustnej pobiera się od osobników lub grup świń, zawieszając w kojcu kawałek bawełnianej sznura, umożliwiając świniom jego gryzienie / żucie, a następnie wyciskanie płynu ustnego z mokrego sznura. Wykazano, że ponad 23 patogeny świń wytwarzają wykrywalne poziomy kwasu nukleinowego i / lub przeciwciał w płynach ustnych, w tym generujące najważniejsze problemy zdrowotne (np. afrykański pomór świń, wirus klasycznego pomoru świń, wirus pryszczycy, wirus grypy, PCV-2, PED i PRRSV). W Ameryce Północnej płyny ustne są szeroko stosowane do monitorowania zdrowia populacji świń, np. w Iowa State University. Veterinary Diagnostic Laboratory wykonało około 1,4 miliona testów na próbkach świńskiego płynu ustnego w latach 2010-2019.

Najpierw najważniejsze:

1. Jakie są Twoje długoterminowe cele zdrowotne? W jaki sposób nadzór pomoże Ci osiągnąć cele związane ze zdrowiem stada?
2. Zrozumienie procesu pobierania płynu ustnego. W Internecie dostępnych jest wiele filmów poświęconych pobieraniu płynu ustnego.

Pobieranie płynu ustnego:

1. Planowanie naprzód. Przygotowanie akcesoriów (sznur, przecinaki, probówki itp.). Przestrzeganie bioasekuracji, tj. unikanie przenoszenia akcesoriów między obiektami.
2. Zbieranie próbek wcześnie rano. Świnie są bardziej aktywne z samego rana. Zbieranie przed karmieniem, jeśli nie jest ono at libitum.
3. Użycie psychologii świń. Gdy świnie po raz pierwszy mają kontakt ze sznurem, należy dać im trochę więcej czasu na oswojenie się z nim (~ 45 minut). Jeśli świnie boją się wiszącego sznura, można go położyć na podłodze (jeden metr z węzłami na każdym końcu) na ~ 30 minut. Kiedy zaczną bawić się sznurem na podłodze, można poprowadzić świnie do miejsca wybranego do zawieszenia sznura, powoli przeciągając go (przeciąganie sznura po podłodze, tak by świnie podążały za nim), a następnie należy zawiesić nowy, czysty fragment sznura, aby go żuły. Zastosowanie atraktantów lub środków aromatyzujących przynosi raczej niewielkie korzyści.
4. Od kogo pobierać? Próbki od świń przed odsadzeniem pobiera się poprzez pobranie rodzinnych płynów ustnych (lochy i prosięta). Płyny ustne indywidualne lub z całych kojców można pobierać od świń w wieku ≥ 21 dni, w tym od macior trzymanych w grupach. Pobieranie płynów ustnych od indywidualnie trzymanych knurów i macior jest możliwe, ale wymaga przeszkolenia zwierząt (patrz # 3) i generalnie nie jest praktyczne w dużych systemach komercyjnych.
5. Postępowanie zgodnie z rutyną. Sznury powinny być wieszane w tym samym miejscu o tej samej porze dnia, aby ustalić rutynę. Świnie szybko nauczą się tego procesu i będą dokładnie wiedziały, co robić przy kolejnych próbobraniach. Po ustaleniu wzorca, czas zbierania można skrócić do 20 minut. Nie należy pozostawiać sznura w kojcu na dłuższy okres czasu (godziny), ponieważ (a) próbka zostanie utracona w miarę wysychania liny; (b) świnie są silne i mogą zniszczyć, jeśli da się im wystarczająco dużo czasu; c) świnie znudzą się sznurem i zaczynają ją ignorować.
6. Unikanie nadmiernego zanieczyszczenia próbki. Dolny koniec wiszącej liny powinien znajdować się na wysokości ramion świń, aby uniknąć kontaktu z podłogą kojca. Materiał organiczny nie wpłynie bezpośrednio negatywnie na działanie testów (RT-PCR lub ELISA), ale czystsze płyny ustne są łatwiejsze do pipetowania i obchodzenia się z nimi w laboratorium.
7. Używanie jednej czystej plastikowej torby i probówki na próbkę. Aby pobrać próbkę, należy umieścić mokrą część sznura w plastikowej torbie, wycisnąć płyn ustny, a następnie umieścić próbkę w pojemniku (wcześniej oznaczonym). Po pobraniu próbki należy usunąć sznur z kojca, aby wisząca lina była zawsze pewną nowością dla świń (znowu - świnie też się nudzą!).
8. Dbanie o próbkę. Natychmiast po zebraniu należy ją schłodzić (4 ° C), umieszczając na lodzie lub w lodówce. Obliczenia oparte na danych z badań Prickett i wsp., (2010) wykazały, że okres półtrwania RNA PRRSV w płynie ustnym na ~ 13 godzin w 30 ° C, ~ 42 godziny w 20 ° C i ≥ 14 dni w <10 ° C . W płynach ustnych nie wykryto żadnych przeciwciał PRRSV po ~ 72 godzinach w 30 ° C.

Zastosowania nadzoru:

1. Ile próbek należy pobierać i jak często? Każdy musi funkcjonować w ramach określonego budżetu. Mimo to nawet kilka próbek (2 do 4) zebranych w każdym budynku (lub pomieszczeniu) w ustalonych odstępach czasu (co 2 do 4 tygodni) da wymowny obraz na temat historii zdrowia stada w odniesieniu do produkcyjności stada (Wykres 1) .
2. Miej plan oceny danych z nadzoru w danym okresie czasu. Na przykład statystyczne wykresy kontroli danego procesu.
3. Użyj „ustalonego próbobrania przestrzennego” w obiekcie, aby zmaksymalizować wykrywanie. Wyjaśnienie tego terminu jest dostępne w Internecie:
   1. Pobieranie płynu ustnego w j. angielskim
   2. Pobieranie płynu ustnego w j. hiszpańskim
4. Oczekuj nieoczekiwanego. Miej plan weryfikacji lub odrzucenia nieoczekiwanych wyników, np. ponowne przebadanie w podwójnym powtórzeniu, ponowne pobranie próbki lub badanie innym testem.
5. Zapamiętaj naturalną historię chorób, aby ustalić plan. Testy opierające sie na wykrywaniu kwasów nukleinowych, [typu PCR] wykryją wczesną obecność wirusa, podczas gdy testy na obecność przeciwciał wykryją pozakaźną i przedłużoną odpowiedź immunologiczną. Obie technologie dobrze razem współdziałają w przypadku nadzoru, np. przy wypuszczaniu zwierząt z kwarantanny.

Inne spostrzeżenia:

1. Zebry i konie… rzeczy, które wydają się podobne, mogą być inne. Próbki, które wydają się podobne do płynów ustnych, np. wymazy z jamy ustnej lub nosa, mogą nie dawać tego samego wskaźnika wykrywalności w danym czasie. Przykłady wirusa grypy A, wirusa pryszczycy, senekawirusa A i PRRSV podano w Tabeli 1.
2. Nie puluj próbek płynu ustnego i nie „przechodź” ze sznurem od kojca do kojca. Zamiast ulepszać wykrywanie, procesy te mogą powodować fałszywie negatywne wyniki.
3. Unikaj zamrażania-rozmrażania i / lub ekstremalnych wahań temperatury. Przeciwciała w płynie ustnym mogą tolerować wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania, ale kwasy nukleinowe nie. Jeśli wymagane są wielokrotne testy na jednej próbce, najlepszym podejściem jest podzielenie próbek na kilka mniejszych porcji, a następnie użycie jednej z nich na badanie. Na fermie nie przechowuj próbek w zamrażarkach samoodmrażających się, ponieważ cykl rozmrażania może uszkodzić kwasy nukleinowe. W laboratorium wykazano, że rozmrażanie próbek płynu ustnego w temperaturze 4 ° C (nie w temperaturze pokojowej) optymalizuje wykrywanie PRRSV RNA (Weiser i in., 2018).

Tabela 1. Porównanie wykrywania kwasu nukleinowego w płynach ustnych z indywidualnymi wymazami z jamy ustnej lub z nosa..

nd = brak danych.

^a Odsetek dodatnich (średnia) oszacowano na podstawie płynów ustnych z całych kojców i pojedynczych wymazów z jamy ustnej. Dane z Hole et al., (2019); Pepin et al., (2015); Romagosa et al., (2012); Senthilkumaran et al., (2017).