Techniki laboratoryjne służące do oceny odpowiedzi immunologicznej świń

Test immunoenzymatyczny (ELISA)

ELISA jest szeroko stosowanym testem do ilościowego wykrywania przeciwciał przeciwko patogenom w płynach biologicznych, mającym wysoką swoistość i czułość. Przeprowadza się go na 96-studzienkowych płytkach do mikromiareczkowania i wykorzystuje interakcję antygen-przeciwciało i zależną od enzymu reakcję kolorymetryczną, fluorescencyjną lub chemiluminescencyjną. Sygnał mierzony jako gęstość optyczna (OD) za pomocą spektrofotometru może być wprost lub odwrotnie proporcjonalny do stężenia/ ilości wykrytych przeciwciał.

W celu wykrycia całkowitych przeciwciał przeciwwirusowych lub przeciwbakteryjnych / mykoplazmowych, stosuje się pośredni test ELISA, w którym antygen patogenu wiąże się w fazie stałej (płytka studzienna), a próbkę inkubuje się do wytworzenia kompleksu antygen-przeciwciało. Następnie dodaje się sprzężone przeciwciało drugorzędowe w celu wygenerowania sygnału odczytu. Ten system umożliwia przeszukiwanie wielu próbek za pomocą jednego sprzężonego drugorzędowego przeciwciała.​

Konkurencyjny i hamujący test ELISA ocenia ilościowo przeciwciała w próbce w oparciu o ich zdolność do wpływania na wstępnie zmiareczkowany test. W obu testach, do wstępnie zmiareczkowanego układu dodaje sie próbke, w której aktywność wiązania przeciwciała określa się na podstawie stopnia interferencji.

Dla przykładu, w celu wykrycia humoralnej odpowiedzi na PRRSV, białko N wirusa jest stosowane do wychwytywania całkowitych przeciwciał swoistych dla PRRSV na 96-studzienkowych płytkach powleczonych antygenem, a wtórne przeciwciało sprzężone z peroksydazą stosuje się do wizualizacji wychwyconego przeciwciała przeciw -PRRSV.

Humoralne odpowiedzi immunologiczne są różne u zwierząt i wykrywane poziomy przeciwciał niekoniecznie odzwierciedlają wirulencję izolatu PRRSV. Ponadto przeciwciała pochodzące od matki (MDA) mogą zaburzać test, prowadząc do wyników fałszywie dodatnich. Zasadniczo, przeciwciała ELISA umożliwiają wykrywanie całkowitych przeciwciał, które są pulą krążących komórek plazmatycznych i specyficznych dla patogenu komórek B pamięci, a zatem, aby prawidłowo wykryć odpowiedź humoralną w pamięci, wykrywanie przeciwciał neutralizujących wirus skierowanych przeciw immunodominującym epitopom jest fundamentalne. Całkowite wykrywanie przeciwciał ELISA może jednak dostarczyć użytecznych informacji na temat serokonwersji i efektu wzmocnienia po kolejnych szczepieniach i/ lub infekcjach

Test neutralizacji wirusa w surowicy (SVN)

Test SVN umożliwia wykrywanie i oznaczanie ilościowe swoistych dla wirusa przeciwciał neutralizujących w surowicy. Dwukrotnie rozcieńczone próbki surowicy i znana ilość wirusa są zazwyczaj wstępnie inkubowane, a następnie dodawane do komórek docelowych wrażliwych na infekcje wirusowe, pozwalając niezneutralizowanemu wirusowi zainfekować komórki w celu określenia najwyższego rozcieńczenia, które może zneutralizować infekcję wirusową, oraz obecności efektu cytopatycznego.

Test SVN jest bardzo czuły i specyficzny, mierzy miano przeciwciał neutralizujących po infekcji lub po szczepieniu. Ocena ilościowa miana może być oparta na obecności lub braku efektu cytopatycznego lub dowodzie infekcji wirusowej przy użyciu immunoreaktywnej techniki. Test SVN jest przydatny do oceny poziomu serologicznej reaktywności krzyżowej pomiędzy surowicami odpornościowymi wirusa i izolatami wirusa w celu oceny i korelacji z ochroną krzyżową.

Test hemaglutynacji (HI)

HI jest serologicznym testem do wykrywania przeciwciał. Wykorzystuje on fakt, iż hemaglutynina wirusów grypy, podobnie jak innych, ma działanie hemaglutynujące na czerwone krwinki. Oznacza to, że krew skrzepnie po dodaniu tych wirusów, ponieważ czerwone krwinki wiążą się z hemaglutyniną na powierzchni wirusa.

Swoiste przeciwciała wywołane humoralną odpowiedzią immunologiczną na infekcję lub szczepienie wirusem mogą hamować aglutynację przez wiązanie z hemaglutyninami.

Jeśli próbka zawiera specyficzne przeciwciała przeciwko hemaglutyninie, dodanie wirusa grypy powoduje reakcję antygen/ przeciwciało. Jest to widoczne po kolejnym dodaniu erytrocytów. Nie są już aglutynowane, ponieważ reakcja jest zahamowana.

Miareczkowanie surowicy można stosować do oznaczania rozcieńczeń, przy których hamuje się hemaglutynację. Odwrotna wartość najwyższego rozcieńczenia, przy której wciąż obserwuje się hamowanie aglutynacji, wyznacza miano przeciwciał.

Test immunoperoksydazowy (IPMA)

Test IPMA jest szeroko stosowany do wykrywania przeciwciał przeciwko wirusom, zwłaszcza tym, które nie wykazują efektu cytopatycznego, takim jak PCV2. Przeciwciała neutralizujące (NA) są głównymi przeciwciałami odpowiedzialnymi za ochronę i usuwanie zakażenia. Ponieważ istnieje dodatnia korelacja między mianami przeciwciał IPMA i mianami VNA, miana IPMA mogą być uważane za pośrednią miarę mian NA. IPMA nie jest testem z wyboru do rutynowej diagnostyki, ponieważ zależy od hodowli komórek zainfekowanych wirusem, a badanie wielu próbek surowicy jest względnie czasochłonne. Z tych powodów IPMA często zastąpuje sie bardziej automatycznymi testami z wykorzystaniem obiektywnego odczytu punktu końcowego, takiego jak ELISA.