0
Wstęp
Zastosowanie testu immunologicznego ELISA (enzyme-linked immunoassay) do wykrywania białek (antygenów lub przeciwciał) jest jednym z najłatwiej dostępnych narzędzi diagnostycznych na całym świecie i jest obecnie szeroko stosowane w medycynie i produkcji trzody chlewnej. Test ten jest powszechnie stosowany w nadzorze i monitorowaniu chorób, jak również jako narzędzie diagnostyczne. Ponieważ lekarze weterynarii często korzystają z tego narzędzia, ważne jest, aby zrozumieć, jak działa test, co wykrywa oraz jakie są jego zalety i wady przy interpretacji wyników. Ważne jest również, aby pamiętać, że chociaż ta sama technologia jest używana dla różnych patogenów, powinny istnieć różnice w sposobie interpretacji wyników.
Informacje dotyczące testu
Testy ELISA są przeznaczone do wykrywania antygenów lub przeciwciał przeciwko bakteriom lub wirusom. Antygeny są obcymi białkami, które stymulują produkcję przeciwciał (antygen = generator przeciwciał). Myśląc o przeciwciałach, zawsze należy myśleć, że są one skierowane przeciwko białkom. Podczas projektowania testu, producent lub laboratorium decyduje, jakie konkretne białko lub białka chce wykrywać. Jeśli test ELISA jest skierowany na białko bezpośrednio na bakterii lub wirusie, jest on nazywany testem antygenowym ELISA, natomiast jeśli celem jest odpowiedź przeciwciał zwierzęcia na bakterię lub wirus, jest on określany jako test przeciwciał ELISA. Chociaż istnieją testy ELISA zaprojektowane tak, aby celować tylko w jedno lub dwa białka (przeciwciała lub antygeny), wiele z nich faktycznie celuje w dużą liczbę białek. Testy mogą być również zaprojektowane do wykrywania określonego typu reakcji przeciwciał (IgG, IgM lub IgA) lub ich kombinacji. Każdy z tych typów przeciwciał ma specyficzne funkcje, które nie wchodzą w zakres tego artykułu.
Koncepcja i proces wykrywania przeciwciał lub antygenów metodą ELISA są dokładnie takie same. Zaczyna się od uzyskania docelowego białka (antygenu lub przeciwciała). W przypadku pojedynczych białek istnieje potrzeba oddzielnego procesu uzyskiwania określonego stężenia danego oczyszczonego białka. Określenie, które białko lub białka mają być docelowe, jest złożonym, naukowym procesem. W idealnym przypadku badanie skierowane jest na pojedyncze białko, które jest unikalne dla danego patogenu (nie wchodzi w reakcje krzyżowe z innymi patogenami), jest wysoce immunogenne (w przypadku wykrywania przeciwciał) lub występuje w wysokich stężeniach (w przypadku wykrywania antygenów); skierowane jest na białko, o którym wiadomo, że jest wysoce skorelowane z ochroną przed chorobą i jest zawsze obecne. Niestety, wiele z tych kryteriów jest nieznanych i często zamiast nich stosuje się to pojedyncze białko, które można łatwo wyprodukować i znaleźć w próbce, lub mieszaninę wielu białek (tj. cały wirus lub bakterie). Chociaż stosowanie całych wirusów lub bakterii jako białek docelowych może być łatwe, istnieje wiele możliwości reakcji krzyżowych z innymi patogenami.
Ogólne etapy tego procesu (Zobacz: Ryc. 1).
- Krok 1. Pokryć mikropłytkę z dołkami docelowym antygenem(-ami) (do wykrywania przeciwciał) lub przeciwciałami (do wykrywania antygenów).
- Krok 2. Dodać próbkę badaną do testu i inkubować, aby umożliwić przyłączenie się antygenu i przeciwciał.
- Krok 3. Usunąć próbkę i dodać na płytkę specjalne przeciwciała, które przylegają do przeciwnej strony przeciwciał (dolna część "Y" przeciwciała do wykrywania przeciwciał) lub antygenu (górna część "Y" do wykrywania antygenu). Płytka jest następnie inkubowana, aby umożliwić przyłączenie się przeciwciała i płukana, aby upewnić się, że wszelkie nieprzylegające (tj. niecelowane) przeciwciała lub antygen zostały usunięte.
- Krok 4. Dodać przeciwciało, które jest oznakowane detektorem, który może dać reakcję barwną i przyłączy się do specjalnych przeciwciał dodanych w kroku 3 (przyłączyć się do dolnej części "Y" przeciwciała; ten sam cel dla wykrywania antygenu lub przeciwciała). Próbka jest następnie ponownie inkubowana, aby umożliwić przyłączenie i przepłukana, aby upewnić się, że wszelkie nie przylegające oznakowane przeciwciała zostały usunięte.
- Krok 5. Dodać odczynnik, który wyzwoli reakcję barwną znakowanych przeciwciał, które pozostały, a następnie pozwolić na inkubację w celu zapewnienia przyłączeni się ich do siebie.
- Krok 6. Próbka jest odczytywana, zwykle przy użyciu specjalnego urządzenia przy określonej długości fali, aby określić ilościowo zmianę koloru (określaną jako absorbancja). Istnieją pewne niewielkie różnice w tym procesie w zależności od tego, czy badanie jest bezpośrednim, pośrednim czy kanapkowym testem ELISA, a każdy z tych testów ma różne zalety i wady (nie omówione tutaj), ale w końcu wszystkie one dają takie same wyniki; im wyższa absorbancja lub zmiana koloru, tym wyższe oczekiwane stężenie docelowego antygenu lub przeciwciała w badanej próbce.
Ryc. 1. Przegląd testów diagnostycznych opartych na metodzie ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Test ELISA może być przedstawiony w różnych formatach w oparciu o różnice w unieruchomieniu antygenu i znakowaniu przeciwciał. W bezpośrednim teście ELISA, antygen(y) wirusa związany(e) z plastikową fazą stałą (tym antygenem jest opłaszczony dołek płytki) jest wykrywany przez dodanie sprzężonego przeciwciała. W teście sandwich ELISA (kanapkowym), to przeciwciało wychwytujące jest przyłączone do plastikowej fazy stałej (dołka płytki). Antygen(y) w próbce wiąże się z przeciwciałem doczepionym do dołka płytki, a następnie jest wykrywany przez drugie przeciwciało znakowane enzymem. W kompetycyjnym teście ELISA, próbka z antygenem wirusa jest preinkubowana z przeciwciałem pierwotnym, a następnie dodawana do dołka plytki, pokrytego przeciwciałem wtórnym, wraz z antygenem sprzężonym z enzymem, który konkuruje z antygenem z próbki o związanie z przeciwciałem pierwotnym, któym opłaszczona jest płytka. Im więcej antygenu wirusa w próbce, tym mniej skoniugowanego antygenu zostanie związane w dołku płytki i tym niższy będzie sygnał. Źródło: Adaptowane z Ghaffari et al. 2020.
Ryc. 2A. ELISA – Obliczanie poziomu antygenu lub przeciwciała na podstawie absorpcji
W przypadku kompetycyjnego testu ELISA, kluczowym punktem jest to, że zastosowany proces w rzeczywistości daje przeciwny wynik (patrz rysunek 2B). Znana ilość znakowanego antygenu (do wykrywania antygenu) lub przeciwciał (do wykrywania przeciwciał) są dodawane do próbki, która ma być oceniana tak, że po dodaniu ich do dołków na płytce, zarówno oryginalna próbka, jak i dodane znakowane białka (przeciwciała lub antygen) konkurują o przyłączenie się do dołków na płytce, które są opłaszczone białkiem. Zasadniczo, jeśli w badanej próbce nie ma białek docelowych, wówczas wszystkie oznakowane białka będą mogły przylgnąć do płytki i wywołać silną zmianę koloru. Z drugiej strony, jeśli w próbce znajduje się znaczna liczba białek docelowych, białka z badanej próbki będą starały się konkurować (blokować) przyłączanie się oznakowanych białek. Kiedy próbka jest płukana, wszelkie oznakowane białka, które nie zostały przyłączone, zostaną usunięte przez płukanie. Tak więc im więcej antygenów lub przeciwciał w próbce, tym bardziej będą one blokować znakowane białka, co spowoduje, że nie zostaną one przyłączone i będą wypłukane. Skutkuje to niską absorbancją, gdy stężenie białek docelowych jest wysokie w próbce, co jest przeciwieństwem poprzedniego przypadku. Wysokie wartości sugerują niskie stężenie lub wynik ujemny i uniemożliwiają ilościowe określenie stężenia antygenu/przeciwciała w próbkach dodatnich.
Ryc. 2B. ELISA kompetycyjna. Obliczanie poziomu antygenu lub przeciwciała na podstawie absorpcji.
Wartość graniczna dla każdego testu ELISA może być inna i jest ustalana przez producenta na podstawie pożądanej docelowej czułości i specyficzności. W przypadku bezpośredniego, pośredniego lub kanapkowego testu ELISA, każda liczba wyższa niż wartość graniczna jest uważana za dodatnią. W przypadku kompetycyjnego testu ELISA, każda liczba wyższa od wartości granicznej jest uznawana za ujemną. Dla niektórych testów, ustalają się również szarą strefę do klasyfikacji próbek jako "podejrzane", ponieważ test ma tendencję do pewnych reakcji "tła" (reakcje krzyżowe), które utrudniają uzyskanie jasnego punktu odcięcia.
Wyniki są zwykle, ale nie zawsze, podawane jako skorygowany stosunek S:P lub stosunek próbki badanej do kontroli dodatniej, który jest skorygowany do zmiany koloru tła w dołkach kontroli ujemnej. Często poziomy przeciwciał są określane jako "miana". Chociaż technicznie nie jest to poprawne, może być uzasadnione z szerszej perspektywy. Kluczowym punktem jest to, że mówiąc o mianach istnieje bezpośredni związek matematyczny pomiędzy wartościami (próbka z wartością 20 ma dwa razy więcej przeciwciał niż próbka o wartości 10). W przypadku wartości ELISA ta bezpośrednia matematyczna zależność nie istnieje (patrz rysunek 2A). Próbka z wynikiem ELISA o wartości 2,0 ma znacznie więcej przeciwciał niż dwa razy w porównaniu do próbki o wartości 1,0.
Łączenie próbek do badań
Ponieważ testy ELISA są zależne od stężenia (są bezpośrednio skorelowane ze stężeniem białka docelowego [przeciwciała lub antygenu]), zdecydowanie odradza się łączenie próbek do testów. Łączenie może znacznie zwiększyć prawdopodobieństwo braku dodatniej próbki.
Niektóre zastosowanie ELISA:
- Wykrywanie obecności przeciwciał przeciwko wybranemu patogenowi - Antibody ELISA - najczęstsze zastosowanie
- Określenie ekspozycji na patogen
- Określenie statusu szczepienia zwierzęcia
- Określenie czasu zakażenia (zmiana poziomu przeciwciał) w czasie.
- Wykrycie obecności docelowego patogenu poprzez wykrycie białka/antygenu docelowego patogenu - Antigen ELISA
