Diagnostyka PRRS: dopasowanie strategii do Twoich scenariuszy

Diagnostyka PRRS ewoluowała przez lata, dzięki czemu obecnie zawiera wiele cennych opcji badań. Rodzaj zwierząt, od których mają być pobrane próbki i charakter procedury pobierania próbek zależą od scenariusza, dla którego wykonujemy badanie: czy powinniśmy badać maciory, prosięta, tuczniki, czy wszystkie? Czy przeprowadzamy próbkowanie celowe czy losowe próbkowanie populacji? I jaka powinna być ilość pobranych próbek? Musimy także zdecydować o rodzaju próbki: czy pobieramy surowicę, tkanki, płyny ustne, czy nasienie? I na koniec, nie możemy zapomnieć o wszystkich pytaniach dotyczących stadium choroby w momencie pobierania próbek. Kiedy pojawiły się objawy kliniczne i czy oczekujemy, że test diagnostyczny wykryje wirusa, zidentyfikuje zmiany patologiczne, czy wykryje przeciwciała? Wreszcie, niezwykle ważne jest, abyśmy rozumieli zalety i ograniczenia każdego testu diagnostycznego.

Zrozumienie każdej z opcji i wybór właściwej strategii diagnostycznej dla każdego scenariusza, dla którego musimy wykonać pobieranie w kierunku PRRS, zwiększy skuteczność każdego programu zarządzania zdrowiem stada.

Scenariusze, dla których wykonujemy próbobranie w kierunku PRRS

Najbardziej oczywistym scenariuszem jest badanie obecności choroby, kiedy objawy potencjalnej epidemii PRRS pojawiają się w negatywnym lub stabilnym pod wzgledem PRRS gospodarstwie. W takim przypadku badanie jest przeprowadzane przez weterynarzy w celu zrozumienia przyczyny objawów klinicznych i pochodzenia patogenu powodującego problemy. Innym bardzo częstym scenariuszem jest monitorowanie braku PRRS w stadzie, który wcześniej było dodatnie i niestabilne, gdzie podjęto strategię kontroli lub zwalczania i należy sprawdzać status i postępy. Wreszcie, testy PRRS są niezwykle powszechne do celów monitorowania choroby. W tym ostatnim scenariuszu badania są przeprowadzane na gospodarstwach ujemnych i zwykle wymagają większej liczby próbek, aby zmaksymalizować stopień pewności statusu populacji wolnej od PRRS.

Nasze cele diagnostyczne kierują wyborem testu

Historycznie podzieliliśmy testy PRRS na 3 typy:

1. Te, które wykrywają zmiany: obserwacje pośmiertne i histopatologia, które można wykonać tylko w laboratorium pod mikroskopem. Testy wykrywania zmian najczęściej stosuje się wcześnie, w klinicznie oczywistych wybuchach PRRS;
2. Te, które wykrywają wirusa: reakcje łańcuchowe polimerazy (PCR), izolacja wirusa (VI) i testy immunohistochemiczne (IHC). Wykrywanie wirusów jest najbardziej niezawodnym narzędziem diagnostycznym do wczesnego potwierdzania obecności wirusa;
3. Te, które wykrywają przeciwciała: test immunoenzymatyczny (ELISA), test monowarstwowy immunoperoksydazowy (IPMA) i pośredni test immunofluorescencyjny (IFA). Immunologiczne potwierdzenie kontaktu z PRRSV wymaga dłuższego okresu wykrywania, ale potwierdza ekspozycję, gdy nie można wykryć wirusa.

Specyfikacja testu warunkuje jego przydatność

Bardzo ważne jest, aby dowiedzieć się, jaka jest CZUŁOŚĆ (SE- sensitivity) i SWOISTOŚĆ (SP- specificity) przy rozważaniu wyboru dowolnego testu. Znajomość tych informacji pomaga właściwie interpretować wyniki i na ich podstawie podjąć adekwatne działania.

• SE to zdolność testu diagnostycznego do prawidłowej identyfikacji prawdziwie dodatnich próbek. Test z niskim SE da zbyt wiele wyników fałszywie ujemnych.
• SP to zdolność testu diagnostycznego do prawidłowej identyfikacji prawdziwie ujemnych próbek. Test z niskim SP da zbyt wiele fałszywie dodatnich wyników.

Możliwości diagnostyczne w scenariuszach PRRS

Wszystkie scenariusze i opcje diagnostyczne zestawiono w Tabeli 1.

1. Badanie wystąpienia wybuchu choroby: W przypadku gospodarstwa doświadczającego wybuchu choroby, celem protokołu diagnostycznego będzie potwierdzenie zakażenia i, jeśli to możliwe, genetyczna charakterystyka szczepu. Wczesne zaangażowanie weterynaryjne w wybuch choroby pomoże skutecznie osiągnąć te cele. Jeśli obecne są świnie z klasycznymi objawami klinicznymi, zdecydowanie zaleca się ukierunkowane pobieranie próbek od tych zwierząt w celu stwierdzenia makroskopowych zmian chorobowych. Po zidentyfikowaniu charakterystycznych zmian (tj. ciężkich, nie zapadniętych płuc o marmurkowym wyglądzie) w terenie, należy wykonać PCR i histopatologię w celu potwierdzenia diagnozy. Należy także przeprowadzić sekwencjonowanie genetyczne w celu zidentyfikowania szczepu. Sekwencjonowanie jest kluczem do zrozumienia epidemiologii (tj. pochodzenia, czy jet to szczep miejscowy, czy nowo pojawiający się) potencjalnego nowego wirusa poprzez porównanie z innymi znanymi już szczepami.

2. Monitoring choroby: W gospodarstwie z pozytywnym wynikiem PRRSV, w celu zminimalizowania negatywnego wpływu choroby z powodu niestabilności produkcji, należy jak najszybciej wdrożyć programy kontrolne (po których czasem następuje ereadykacja) w celu wyprodukowania negatywnych prosiąt. Celem programu diagnostycznego w tym przypadku będzie wykazanie kluczowych parametrów wskazujących stabilność PRRS (tj. aklimatyzacja loszek, odporność stada hodowlanego i produkcja ujemnych prosiąt). Serologia służy do potwierdzenia skutecznej ekspozycji loszek i stada hodowlanego, a PCR służy do potwierdzenia braku wirusa u nowonarodzonych i odsadzonych prosiąt. W tych warunkach stosujemy testy o wysokim SE (tj. najmniejszej możliwej liczbie fałszywie ujemnych). Ponieważ mamy do czynienia z fermą, w której spodziewana częstość występowania prosiąt pozytywnych pod względem PRRS może być bardzo niska lub nieobecna, wymagana będzie duża liczba próbek w celu potwierdzenia statusu PRRS z dużym stopniem pewności. Zakładając brak prosiąt z kliniczną postacią choroby, losowo wybrane prosięta i nowo wprowadzone ujemne loszki w gospodarstwie są naszymi najlepiej ukierunkowanymi populacjami do pobierania próbek. Większość rodzajów próbek (tj. surowica, płyny ustne, płyny technologiczne pochodzące z kastracji i obcinania ogonów, tkanki) jest wartościowych, ale ważne jest, aby zrozumieć różnice SE i SP między testami podczas oceny wyników. W miarę możliwości należy zawsze brać pod uwagę pulowanie, aby analiza była tańsza.

3. Nadzór nad chorobą: Prowadząc nadzór nad chorobami w gospodarstwach ujemnych, zwykle wybieramy testy o możliwie najwyższym SP (tj. najmniej wyników fałszywie dodatnich). Farmy te (tj. ośrodki inseminacji lub namnażania) przy wielu okazjach muszą rutynowo dokumentować swój status. W przypadku ferm loch test ELISA jest najlepszą opcją do wykazania braku ekspozycji na PRRS. Jest niedrogi, szybki i ma dobre SE i SP. W tych gospodarstwach często przeprowadza się ponowny test serologiczny w celu ustalenia, czy nieoczekiwane wyniki dodatnie (zwykle 1–2% wszystkich próbek) są prawdziwe, czy fałszywie dodatnie. Pośredni test immunofluorescencyjny (IFA) lub test mono-warstwowy immunoperoksydazowy (IPMA), oba oparte na pośrednim barwieniu wstępnie przygotowanych monowarstw zainfekowanej komórki, służą jako testy potwierdzające nieoczekiwany pozytywny wynik testu ELISA. PCR jako test wczesnego wykrywania stosuje się na: 1) płynach ustnych przed dostawą loszek zastępczych w wieku rozrodczym; oraz 2) surowicy lub krwi od knurów w centrach inseminacji.

Podsumowując, wybór odpowiednich testów we właściwym czasie i na odpowiednio dobranych zwierzętach oraz ich poprawna interpretacja zwiększy szybkość, dokładność i opłacalność naszych strategii diagnostycznych PRRS.

Tabela 1. Podsumowanie scenariuszy i strategii diagnostycznych

Badanie wystąpienia wybuchu choroby

1. Status PRRS fermy
   • Niestabilna
   • Aktywna transmisja wirusa
   • Nowe wprowadzenie PRRS
   • Wysoka prewalencja choroby
2. Cele diagnostyczne
   • Wykrycie zakażenia
   • Identyfikacja szczepu PRRSV
3. Zwierzęta
   • Te z objawami klinicznymi
   • Martwo urodzone
4. Typy próbobrania
   • Próbobranie celowane
   • Niewielka liczba zwierząt
   • Pulowanie próbek
5. Próbka
   • Tkanka
   • Surowica
6. Pierwsza opcja diagnostyczna
   • Sekcja w celu identyfikacji zmian
   • Zalety
     • “Bardzo szybka”
     • Na fermie
     • Tania
   • Wady
     • Niskie SE/SP
7. Druga opcja diagnostyczna
   • PCR/ sekwencjonowanie wirusa w celu wykrycia/ zidentyfikowania szczepu PRRSV
   • Zalety
     • Wysokie SE/SP
     • Szybkie, 24h
     • Wyniki ilościowe (RT-qPCR)
   • Wady
     • Potencjalnie fałszywie dodatnie ze względu na ryzyko kontaminacji: konieczne zapewnienie odpowiedniego obchodzenia się z próbką (podczas próbobrania i dalszych procesów)

Monitoring choroby

1. Status PRRS fermy
   • Stabilny
   • Szczep PRRSV będący w fermie od dłuższego czasu
   • Niska prewalencja choroby
2. Cele diagnostyczne
   • Monitoring stabilności/ kontroli
   • Monitoring programów eradykacji
3. Zwierzęta
   • Prosięta (noworodki i odsadzone)
   • Loszki
4. Typy próbobrania
   • Próbobranie losowe/ duża liczba zwierząt
   • Próbobranie celowane/ mniejsza liczba zwierząt
   • Próbki pulowane
5. Próbka
   • Płyn ustny
   • Surowica
   • Płyny technologiczne
   • Płyny z języków prosiąt
6. Pierwsza opcja diagnostyczna
   • PCR w celu wykrycia materiału genetycznego (RNA) od ≈7 dni od początku infekcji
   • Zalety
     • Wysokie SE/SP
     • Szybki 24h
     • Wyniki mogą być ilościowe (RT-qPCR)
   • Wady
     • Potencjalnie fałszywie dodatnie ze względu na ryzyko kontaminacji: konieczne zapewnienie odpowiedniego obchodzenia się z próbką (podczas próbobrania i dalszych procesów)
7. Druga/ alternatywna opcja diagnostyczna
   • ELISA w celu wykrycia przeciwciał (IgM, IgG, N) od ≈14 dni od początku infekcji
   • Zalety
     • Niski koszt w przeliczeniu na próbkę
     • Wyniki w ciągu 2-4 dni
     • Potwierdza brak zetknięcia się z wirusem w przeszłości
   • Wady
     • Niższe SP
     • Nie różnicuje ekspozycji szczepionkowej od terenowej
     • Wyniki nie są ilościowe

Nadzór nad chorobą

1. Status PRRS fermy
   • Ferma PRRS ujemna
2. Cele diagnostyczne
   • Upewnienie się co do statusu ujemnego
3. Zwierzęta

Lochy Loszki/ prosięta Loszki remontowe 4. Typy próbobrania Losowe Duża liczba zwierząt Próbki pulowane	Knury AI 4. Typy próbobrania Losowe Duża liczba zwierząt Próbki pulowane Próbobranie celowane
5. Próbka Surowica Sznury (płyn ustny)	5. Próbka Surowica Krew
6a. Pierwsza opcja diagnostyczna (stado loch, loszki, prosięta) ELISA do wykrywania przeciwciał (IgM, IgG, N) od ≈14 dni po zakażeniu Zalety Niski koszt na próbkę Wyniki w 2-4 dni Potwierdza brak ekspozycji na wirusa w przeszłości Wady Niższe SP Nie różnicuje ekspozycji szczepionkowej od terenowej Wyniki nie są ilościowe 6b. Pierwsza opcja diagnostyczna (Loszki rozrodowe remontowe) PCR do wykrywania materiału genetycznego (RNA) 72 h od początku zakażenia Zalety Wysokie SE/SP Szybki wynik w 24h Wyniki mogą być ilościowe (RT-qPCR) Wady Potencjalnie fałszywie dodatnie ze względu na ryzyko kontaminacji: konieczne zapewnienie odpowiedniego obchodzenia się z próbką (podczas próbobrania i dalszych procesów) 7. Druga opcja diagnostyczna IFA/IPMA do wykrywania przeciwciał (IgM, IgG) od ≈14 dnie od początku zakażenia Zalety Wyższe SP Wyniki w 4 dni Do potwierdzenia fałszywie + wyników ELISA Wyniki mogą być ilościowe Wady Zróżnicowane SE Na wyniki duży wpływa mają umiejętności osoby wykonującej test	6. Pierwsza opcja diagnostyczna PCR do wykrywania materiału genetycznego (RNA) 72 h od początku zakażenia Zalety Wysokie SE/SP Szybki, 24h Wyniki mogą być ilościowe (RT-qPCR) Wady Potencjalnie fałszywie dodatnie ze względu na ryzyko kontaminacji: konieczne zapewnienie odpowiedniego obchodzenia się z próbką (podczas próbobrania i dalszych procesów)