0
Wykrywanie antygenów wirusa PRRS
Jednoznaczne rozpoznanie PRRS u chorych świń może być postawione w wyniku wykrycia zmian mikroskopowych charakterystycznych dla zakażenia PRRSV w połączeniu z wykryciem antygenów wirusowych w zmienionych tkankach. Do wykrywania PRRSV w tkankach można wykorzystać test fluorescencji (FA) na skrawkach mrożeniowych i test immunohistochemiczny (IHC) na tkankach utrwalanych w formalinie (Ryc. 1). Testy te opierają się na wykorzystaniu przeciwciał monoklonalnych lub poliklonalnych swoistych dla PRRSV. Bezpośredni test FA na skrawkach zamrożonych tkanek jest metodą tanią, szybką i specyficzną. Nie zawsze jednak metoda ta jest wystarczająco czuła. Niedostateczna jakość materiału (np. autoliza) wpływa ujemnie na ostateczny wynik badania. Z drugiej strony IHC jest metodą bardziej czułą niż FA, lecz bardziej pracochłonną i droższą.
Ryc. 1. Antygen PRRSV wykryty w tkance.
W celu przeprowadzenia badania FA należy dostarczyć tkankę świeżą lub zamrożoną. Do badania IHC tkanka powinna być utrwalona w 10% zbuforowanej formalinie. Zbyt długi czas utrwalania może mieć negatywny wpływ na przebieg testu IHC. Jeśli badanie ma być przeprowadzone później, utrwaloną w formalinie tkankę można umieścić w alkoholu. Tkanki przydatne do badania FA i IHC to serce, nerki, płuca, węzły chłonne, śledziona, grasica i migdałki. Antygen PRRSV może być wykryty również w nadnerczach, jelitach, wątrobie i niekiedy w mózgu. Przy wykonywaniu badania FA lub IHC można wykorzystywać przeciwciała monoklonalne dla antygenów konserwatywnych dla szczepów amerykańskich i europejskich, lub też specyficznych dla każdego z typów wirusa, do różnicowania zakażeń. Jeśli diagnostyka PRRS ma być wykonywana metoda FA lub IHC, ze względu na dużą zmienność antygenową PRRSV, najlepiej jest korzystać z więcej niż jednego przeciwciała, aby zwiększyć prawdopodobieństwo prawidłowej diagnozy.
Wykrywanie materiału genetycznego PRRSV
Do wykrywania RNA PRRSV służy wiele testów wykorzystujących reakcję polimeryzacji łańcuchowej (PCR). W tym celu nie jest konieczna izolacja wirusa w hodowli komórkowej a wirusowy RNA może być wykrywany bezpośrednio z materiału biologicznego od świń. Testy oparte na PCR są uważane za czułe i swoiste.
Figure 2. Wykrywanie materiału genetycznego PRRSV w materiale klinicznym przy pomocy PCR w czasie rzeczywistym (real-time PCR).
Każdy test diagnostyczny wykorzystujący PCR wymaga aby RNA wirusowe zostało najpierw wyizolowane z materiału klinicznego, a następnie przepisane na komplementarne DNA (cDNA) przy pomocy enzymu, odwrotnej transkryptazy (RT). Następnie cDNA jest ekspotencjalnie amplifikowane (powielane) w procesie enzymatycznym przy pomocy krótkich fragmentów DNA komplementarnych do genomu wirusa (primerów) i termostabilnej polimerazy DNA (Taq polimeraza). Precyzyjne dopasowanie sekwencji primerów i ekspotencjalne powielanie fragmentu genomu powoduje, że testy oparte na PCR są zarówna bardzo specyficzne jak i bardzo czułe. W ostatnich latach opracowano testy PCR wykorzystujące zjawisko fluorescencji co umożliwiło znaczny poziom automatyzacji (Ryc. 2). W takich testach sondy fluorescencyjne wiążą się produktami PCR co można obserwować w czasie rzeczywistym (real-time PCR). Uważa się, że takie testy są lepsze od testów z konwencjonalnym wykrywaniem produktów PCR (Ryc. 3).
Ryc. 3. Wykrywanie materiału genetycznego PRRSV w konwencjonalnym teście PCR.
PCR-based tests have been used on a variety of clinical specimens, as well as oral fluid and environmental samples, for detection of PRRSV RNA. PCR is particularly useful for the detection of viral RNA in samples like semen or feces that are either cytotoxic for cell culture or cannot be evaluated by other methods. It has also been found useful for detection of PRRSV RNA in fetal tissues and thoracic fluids, i.e., samples in which PRRSV can be easily subjected to inactivation by the process of autolysis. The use of PCR assays has become more common both for the diagnosis of PRRS and to aid in herd monitoring/surveillance (i.e., screening of replacement animals, detection of carrier animals, and test and removal programs) or biosecurity (i.e., environmental testing, truck checking, semen testing).
PCR is expensive relative to other diagnostic methods. Furthermore, it should be kept in mind that a positive result on PCR indicates the presence of viral RNA and does not necessarily indicate the presence of infectious PRRSV. In addition, the performance of PCR testing among different laboratories may vary depending upon sample condition, sample processing, extraction technique, primers used, thermal cycling conditions, and the skills and experience of the technician performing the assay. Therefore, it is important for laboratories performing PCR to validate their assays, which should include estimates of sensitivity, specificity, comparisons to “gold standards”, proficiency testing results, and experimental or field studies of assay performance.
