LAMP: prosta, szybka i niedroga alternatywa dla PCR?

Testy na obecność kwasów nukleinowych stały się standardem w ustalaniu obecności patogenów w próbkach diagnostycznych. Powszechną procedurą testowania kwasów nukleinowych stosowaną w laboratoriach diagnostycznych i badawczych jest reakcja łańcuchowa polimerazy czyli PCR. PCR to proces, który stopniowo amplifikuje niewielki fragment DNA do punktu, w którym staje się wykrywalny jako pasmo na żelu lub jako wykrywalny maszynowo sygnał fluorescencyjny i może być ona przeprowadzona w ciągu kilku godzin. DO uzyskania wiarygodnych wyników i dobrej pracy z PCR wymagane są znaczne wydatki na specjalistyczny sprzęt, taki jak termocyklery, specjalistyczne laboratorium oraz przeszkolony i doświadczony personel.

Czym jest LAMP?

Pętlowa amplifikacja izotermiczna (LAMP) stała się prostą, szybką, czułą i dokładną metodą amplifikacji i wykrywania DNA/RNA, która nie wymaga zaawansowanego sprzętu i jest stosunkowo niedroga. Reakcję przeprowadza się w pojedynczej mikroprobówce. Wymagany sprzęt do prostej metody LAMP to pipetor, jednorazowe pipety i blok grzewczy z suchą łaźnią. Łaźnia wodna lub zwykły inkubator, a nawet termosy z gorącą wodą mogą wystarczyć jako źródło ciepła, ale dla lepszej higieny laboratorium kwasów nukleinowych wysoce pożądany jest suchy blok grzewczy (rysunek 1).

W typowym zastosowaniu LAMP, mieszanina w probówce będzie zawierać:

• Sześć fragmentów DNA zwanych starterami, które pasują do wykrywanej sekwencji DNA.
• Specyficzny enzym polimerazy (np. polimeraza DNA BST)
• Bufory
• Odczynniki wspomagające reakcję
• Barwnik wskaźnikowy (wskaźnik pH lub bezpośredni barwnik DNA)
• Odwrotna transkryptaza dla wirusów RNA
• Badana próbka.

Mieszanina ta jest inkubowana w temperaturze 60-65°C przez 30 minut. Jeśli DNA pasujące do starterów jest obecne w próbce, powstaje seria pętli DNA w kształcie hantli. Pętle stają się bardziej złożone i liczniejsze w miarę postępu reakcji amplifikacji (Rysunek 2).

Amplifikacja polimerazy wytwarza pirofosforan magnezu jako produkt uboczny, który powoduje zmętnienie w probówce. Barwniki wskaźnikowe, które wiążą się bezpośrednio z DNA, dają widzialne widmo lub sygnał fluorescencyjny UV. Jeden z systemów LAMP wykorzystuje wskaźnik pH czerwieni fenolowej, który zmienia kolor z różowoczerwonego na żółty.

Rysunek 3 przedstawia wynik testu LAMP dla afrykańskiego pomoru świń (ASF) - probówka A zawierała ekstrakt ze śledziony lochy, która padła na ASF. Wysoka zawartość DNA wirusa generuje nieprzezroczysty żółty kolor. Probówka B była wymazem z jamy ustnej z typowym niższym obciążeniem wirusem ASF od tej samej lochy. Zmętnienie w probówkach A i B jest widoczne poprzez zaciemnienie linii tła. Probówki od C do F są wątpliwe i ujemne.

Istnieją pewne warianty reakcji LAMP jako widgetu tematycznego. Test może być stosowany w zamkniętych 96-dołkowych mikropłytkach z barwnikami kolorymetrycznymi lub fluorescencyjnymi lub pomiarami zmętnienia w celu uzyskania ilościowego i zautomatyzowanego wyniku. Fotokomórki filtrujące w bloku cieplnym i odpowiednia dioda LED mogą również zautomatyzować półilościowy odczyt fluorescencyjny w czasie rzeczywistym w mikroprobówkach. Z kolei fotometria za pomocą aparatu w telefonie komórkowym może w niektórych przypadkach, w których ludzkie oczy nie są w stanie rozstrzygnąć dylematu w sposób satysfakcjonujący, przekształcić podejrzane probówki w binarne logistyczne "tak" lub "nie".

Reakcję LAMP można przeprowadzić na miejscu w terenie, aby uzyskać praktyczne wyniki "Point-of-Care" przy minimalnym czasie oczekiwania. Nasze laboratorium skonstruowało i zweryfikowało niedrogie testy LAMP (od "zera" i z "zestawów") dla klasycznego pomoru świń (CSF), cirkowirusa świń typu 2 (PCV2) i ASF (jak wyżej) jako weryfikację poprawności (dla CSF), że można dość tanio przebadać partię zwierząt hodowlanych przed wprowadzeniem pod kątem trwałej infekcji za pomocą testów LAMP.

Zaletami LAMP są szybkie wyniki testu, minimalne przeszkolenie, niskie inwestycje w sprzęt, niewielka powierzchnia laboratorium i ogólnie niski koszt na próbkę. Chociaż koszty mogą być zróżnicowane, koszt LAMP jest ogólnie przedstawiany jako około połowa kosztu PCR i jest dalej zmniejszany w przypadku prostych matryc, w których etap ekstrakcji kwasu nukleinowego jest niepotrzebny. Laboratoria, które chcą zainwestować w opracowanie LAMP od podstaw przy użyciu stosunkowo tanich odczynników i własnych zestawów starterów, potencjalnie unikają wbudowanego wyższego kosztu gotowego do użycia zestawu, ale ponoszą koszty związane z rozwojem, weryfikacją i certyfikacją.

Czułość i swoistość LAMP jest porównywalna z czułością i swoistością PCR, a wyniki można uzyskać w ciągu 30 minut. Niektóre regiony zatwierdziły komercyjne zestawy testowe LAMP dla ASF i ludzkiego Covid-19.

Wady LAMP mogą obejmować jej nieznajomość wśród niektórych pracowników akademickich i badawczych oraz pewien sceptycyzm wobec tej metody. LAMP wymaga 6 (do 8) starterów dla każdego wykrywanego genu, a opracowywanie starterów jest trudniejsze niż w przypadku konwencjonalnej PCR, ale dostępne są narzędzia online, które pomagają w tym procesie. W przypadku wysoce mutowalnych wirusów RNA, takich jak PRRS, może być wymagane zastosowanie wielu zestawów starterów, ale nie wyklucza to użyteczności tej metody. LAMP generuje dużo DNA, a dodatnie probówki nie powinny być otwierane po teście, aby uniknąć zanieczyszczenia laboratorium. Amplikony LAMP nie są łatwe do sekwencjonowania, a laboratorium może być zmuszone do zorganizowania konwencjonalnego PCR lub innych metod dla próbek LAMP-dodatnich, gdy wymagane są sekwencje genów.

Można łatwo wyobrazić sobie zastosowanie LAMP w obiektach sprzedaży zwierząt gospodarskich, punktach skupu zwierząt i rzeźniach, a także w warunkach prymitywnych i odległych miejscach, gdzie nie można zabrać wrażliwego i drogiego sprzętu. Tam, gdzie zaawansowane urządzenia, a nawet elektryczność są niedostępne, a binarne odpowiedzi tak/nie są niezbędne do działania człowieka w czasie rzeczywistym na miejscu, LAMP może zapewnić wyraźną drogę naprzód. Niskie koszty i brak zapotrzebowania na sprzęt nieco utrudniły rozpowszechnianie LAMP, ponieważ firmy i laboratoria uniwersyteckie mogą preferować drogie obiekty fizyczne, a marginalny zwrot z inwestycji może być ważniejszy niż rzeczywisty koszt usług opieki zdrowotnej opartych na opłatach.

W miarę jak świat zmierza w kierunku kontroli i eliminacji ważnych endemicznych chorób transgranicznych, takich jak afrykański pomór świń (ASF), PRRS i klasyczny pomór świń (CSF), dostępność szybkiego, wygodnego i opłacalnego testu ma potencjalną użyteczność.

"Być może bycie zbyt praktycznym jest szaleństwem". - Miguel de Cervantes Saavedra (1547-1616), Don Kichot.