Odporność błon śluzowych a E. coli

Poodsadzeniowa biegunka prosiąt jest jedną z najpoważniejszych przyczyn strat ekonomicznych w produkcji trzody chlewnej. Charakteryzuje się ona wysoką częstotliwością występowania biegunek i spowolnieniem wzrostu zwierząt. Wywoływana jest przez zakażenie enterotoksycznymi szczepami E.coli. Różnego typu stresory, takie jak wczesne odsadzenie (pomiędzy 17 a 28 dniem życia) powodują powstawanie reakcji stresowych, co prowadzi do zaburzeń mikroflory jelitowej, oraz wpływa na jakość odporności błony śluzowej jelit. Prawdopodobnie żadna inna dziedzina nauki w ciągu ostatnich 5 latach nie została tak wnikliwe przebadana jak immunologia błony śluzowej jelit. Stan komórek tworzących błonę śluzową, wyściełającą układ pokarmowy jest ważny nie tylko dla prawidłowego wzrostu i rozwoju świni przez wydzielanie i wchłanianie substancji, ale te komórki (znane także jako enterocyty) tworzą największy narząd odpornościowy organizmu świni i stoją na pierwszej linii kontaktu z drobnoustrojami w jelitach.

Komórki kubkowe które są odpowiedzialne za wydzielanie śluzu i mucyn zapewniają pierwszą barierę ochronną.(Rysunek 1, Rysunek 2) (Varum i in., 2010, i Pelaseyed i wsp. 2014). Komórki nabłonka błony śluzowej poprzez produkcje mucyn również wpierają działanie tej bariery. (Maynard et al. 2012 and Chase et al. 2012). Bariera ta zawiera także peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMP) które są również produkowane przez enterocyty.(Rysunek 2) Powstawanie AMP jest indukowane przez mikroflorę bakteryjną przewodu pokarmowego, jak również przez komórki układu odpornościowego: komórki NK (natural killer) i limfocyty Ti (Rysunek 2)(Chase et al. 2012). AMP (znane również jako peptydy obronne gospodarza HDPs) są ważnym rodzajem cząsteczek które przyczyniają się do utworzenia bariery chemicznej w celu ograniczenia możliwości zakażeń na powierzchni nabłonka jelit. U świń zidentyfikowana i scharakteryzowano ponad 30  rożnych peptydów HDP (Maynard et al. 2012). Cząsteczki AMPs są stosunkowo małymi peptydami kationowymi znajdującymi się przeważnie na powierzchni błon śluzowych oraz w komórkach fagocytujących. Różnią się one pod względem struktury i aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Koncentracja niektórych cząsteczek HDP zwiększa się w wyniku pojawienia się stanu zapalnego lub zakażenia drobnoustrojami. Wydzielnicze przeciwciała IgA (sIgA) są produkowane gdy dimeryczny IgA jest wydzielany przez komórki plazmatyczne blaszki właściwej a następnie jest transportowany na powierzchnie błony śluzowej komórek nabłonka (Rysunek 2) (Maynard i wsp. 2012). Wydzielnicze przeciwciała IgA odgrywają ważna role w tworzeniu odporności błon śluzowych poprzez aglutynacje czynników zakaźnych, uniemożliwiając im przyleganie do powierzchni komórek nabłonka oraz przez neutralizacje toksyn. Wewnętrzna warstwa śluzu wraz z cząsteczkami AMP i wydzielniczymi IgA tworzą "strefę śmierci" którą tylko nieliczne patogeny i komensale mogą spenetrować (Rysunek 2). Ta "strefa śmierci" wraz ze ścisłymi połączeniami pomiędzy enterocytami tworzą "bariery" dla E.coli i innych patogenów jelitowych.

Rysunek 1. Bariera z śluzu i mucyn w układzie pokarmowym. Śluz jest przedstawiony jako kolor ciemnoniebieski a bakterie w postaci czerwonych punktów. Zaadaptowane z  Pelaseyed, T., et al. (2014). Immunological Reviews, 260(1), 8–20.

Rysunek 2. Odporność błony śluzowej przewodu pokarmowego. Rożne subpopulacje komórek nabłonkowych jelita (IECs) tworzą ciągła strefę, zbudowaną z jednej warstwy komórek która jest podzielona na obszary: wierzchołkowy, boczono-podstawmy oraz obwodowy. Enterocyty oraz wyspecjalizowane komórki Panetha odbierają sygnały mikroflory i produkcją peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMPs). Komórki kubkowe wytwarzają śluz, który można podzielić na gęsty złożony z zwartej sieci proteoglikanów tworzących wewnętrzną warstwę, oraz mniej złożona zewnętrzna wartswę śluzu. Zewnętrzna warstwa jest mocno skolonizowana przez składniki mikroflory. Wewnętrzna warstwa śluzu jest w dużym stopniu odporna na kolonizację bakterii lub penetracje ze względu na wysokie stężenie AMP a także specyficznych wydzielniczych przeciwciał IgA, które są przenoszone z boczno-podstawnej strefy gdzie jest związany z receptorem. Oddziaływanie mikrobioty powoduję wytwarzanie cytokin przez komórki limfoidalne, tkankę limfatyczną i limfocyty T oraz NK, co stymuluję produkcje AMP i tworzenie bariery nabłonkowej. Zaadoptowano z Maynard et al., Nature 489, 231–241 2012

Pozostałe elementy odpowiedzi immunologicznej mogą być istotne w ochronie przed różnymi typami infekcji na powierzchni błony śluzowej jelit. Neutrofile u świń mogą migrować do światła jelit w dużych ilościach w odpowiedzi na powstawanie kompleksów antygen-przeciwciało a następnie zabić E.coli. Migracja białych krwinek obojętnochłonnych do światła jelit i ich późniejsze działanie skutkuje wzrostem stężenia laktoferyny, lizosomu i kationowych białek. Substancje te mogą również przyczyniać się do odporności na infekcje bakteryjne w jelicie (Maynard, i wsp. 2012).

Odsadzenie jest wydarzeniem stresogennym dla młodych świń. Odsadzenie przed 3 tygodniem życia skutkuje długotrwałymi negatywnymi skutkami na układ odpornościowy i rozwoju błony śluzowej jelit. Wczesne odsadzenia w 17-21 dniu życia skutkuje długotrwałym podwyższeniem poziomu hormonów stresowych, np.  czynnik uwalniający kortykotropinę (CRF), oraz wzrostem ilości komórek tucznych, co wynika z zaburzeń śluzówki jelita. (Chase et al. 2012)

Rysunek 3. Prawidłowa odporność błony śluzowej jelit i zaburzenia w składzie prawidłowej mikroflory. Mikroflora jelit wpiera odporność na trzech poziomach. (I) Nasycenie obszarów kolonizacyjnych i konkurencja o składniki pokarmowe z bakteriami chorobotwórczymi. (II) "Strefa śmierci" - komensale uzupełniają barierę przez produkcje mucyny, immunoglobulin IgA oraz przeciwdrobnoustrojowych peptydów (AMPs) przez co dodatkowo chronią przed kontaktem patogenu z błoną śluzowa gospodarza. (III) Ostatecznie mikro biota wzmacnia odpowiedz immunologiczna na zakażenie. Dzieje się tak w wyniku wspierania IL-22 przez limfocyty T i NK, co zwiększa odporność nabłonka jelit, a także przez wydzielanie IL-1 przez monocyty jelit (MK) i komórki dendrytyczne jelit (DCs) które to rekrutują komórki zapalne w miejsce zagrożenia. W warunkach gdy dochodzi do zaburzenia w składzie prawidłowej mikroflory, odporność barier a w konsekwencji ochrona przed inwazją jest ograniczona. Khosravi and Mazmanian, Current Opinion in Microbiology 2013, 16:221–22

Stres związany z odstawieniem od lochy, wiek odsadzenia, tworzenia hierarchii w nowej grupie, nagła zmiana żywienia wpływa na ekosystem mikroflory bakteryjnej jelit oraz zmniejsza odporność na kontakt z patogenem co prowadzi do zwieszonego ryzyka wystąpienia choroby, szczególnie poodsadzeniowej biegunki prosiąt. (Fouhse et al. 2016) Poodsadzeniowa biegunka charakteryzuje się zmniejszeniem ilości dobrych bakterii - komensali np. Lactobacillus spp. a wzrostem patogenów E.coli  (Fouhse et al. 2016). Prowadzi to do dysbiozy- strat dobrych bakterii na rzecz organizmów szkodliwych, takich jak E.coli (Fouhse et al. 2016 and Khosravi et al. 2013) (Rysunek 3) Jednak dysbioza to nie tylko utrata mikroflory, ale także wyczerpanie "strefy śmierci" - Warstwa śluzu staje się cieńsza a ilość sIgA i AMp spada gwałtownie, wiec bariera słabnie i patogeny mają ułatwioną drogę wejścia. Patogeny takie jak enterotoksyczna E.coli może wejść w kontakt z błoną śluzową jelit i spowodować chorobę. Ważnym czynnikiem prowadzącym do zaburzeń w składzie mikroflory jelitowej i wystąpienia poodsadzeniowej biegunki prosiąt jest niskie pobranie paszy i wody. (Fouhse et al. 2016). Niechęć do jedzenia po odsadzeniu i odwodnienie prowadzi do zmian strukturalnych w jelitach, w tym zaniku kosmków jelitowych i rozrostu krypt, co dodatkowo prowadzi do dysfunkcji bariery jelitowej. (McLamb et al. 2013). Wczesne odsadzeni, poniżej 20 dni skutkuje wzbudzeniem reakcji wrodzonej z mniejsza liczba neutrofili i cytokin prozapalnych koniecznych do zwalczenia infekcji E coli. (McLamb et al. 2013). Co więcej redukcja liczby bakterii wytwarzających kwas mlekowy (Lactobacillus) podczas odsadzenia podnosi pH jelit, w konsekwencji zwiększa się podatność na choroby, ponieważ to niskie pH jest bakteriobójcze dla E.coli (Fouhse et al. 2016). Prowadzone badania na odsadzanych prosiętach w zakresie wzrostu symbiotycznych mikroorganizmów i redukcji oportunistycznych patogenów ma na celu zminimalizowanie zaburzeń składzie mikroflory jelit.