0
Metody wykrywania przeciwciał dla PRRSV
Do wykrywania przeciwciał dla PRRSV wykorzystywany jest test fluorescencji pośredniej (IFA), test seroneutralizacji wirusa (SVN), test immunoperoksydazowy (IPMA), i test ELISA. IFA, SVN i ELISA są dostępne w większości amerykańskich laboratoriów diagnostycznych, a IPMA jest powszechnie używany w Europie. Wszystkie testy są uważane za specyficzne i mają różną czułość. Zwykle IFA, IPMA i ELISA służą do wykrywania całkowitych przeciwciał IgG swoistych dla PRRSV, a SVN do wykrywania przeciwciał pełniących funkcję w odporności przeciwzakaźnej. IFA i ELISA zaadaptowano do wykrywania innych izotypów przeciwciał, jak IgM czy IgA (Ryc. 1). Przeciwciała IgG swoiste dla PRRSV, które mogą być wykrywane w IFA, IPMA czy ELISA, są produkowane przez zakażone świnie między 7 i 14 dniem po infekcji. Przeciwciała wykrywane w SVN są wykrywane po 1-2 miesiącach od infekcji (Ryc. 2). Ogólnie mówiąc, przeciwciała powstające w wyniku infekcji PRRSV mogą być łatwo wykrywane przez 3-4 miesiące, a mogą się utrzymywać przez 6 do 12 miesięcy.
Ryc. 1. Serokonwersja IgM u młodych świń po doświadczalnej infekcji wykryta zmodyfikowanym testem IDEXX PRRS ELISA 2XR. Grupy 1 i 2 zakażono donosowo w dniu 0 szczepem PRRSV Typ 2. Grupa 1 była była powtórnie zakażona w 196 dniu, a grupa 2 nie była powtórnie zakażona. Grupa 3 nie była zakażona aż do 196 dnia. Przeciwciała IgM wykryto w 7 dniu po zakażeniu a ich poziom szybko uległ obniżeniu po 14 dniach (Nezami S i Yoon KJ, dane niepublikowane)
Ryc. 2. Przeciwciała dla PRRSV u świń w różnym czasie po zakażeniu mierzone testem IFA (A), IPMA (B), SVN (C), ELISA (D). (Zaadaptowano z z publikacji Yoon K-J i wsp.: Characterization of the humoral immune response to PRRSV infection. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 7:305-312, 1995)
Testy IFA i IPMA wykorzystują zakażone wirusem komórki jako antygen (Ryc. 3). Przewagę IFA i IPMA nad testem ELISA stanowi rząd wielkości miana przeciwciał jaki można badać. Miana przeciwciał w IFA mogą się wahać między laboratoriami ponieważ interpretacja testu jest subiektywna. Ponadto, wyniki IFA mogą być różne w zależności od pokrewieństwa antygenowego szczepu PRRSV użytego w teście i szczepu, który zakażał świnię.
Ryc. 3. Fotografia mikroskopowa fluorescencji komórek Marc-145 zakażonych wirusem PRRSV inkubowanych z surowicą świń zawierającą swoiste dla PRRSV przeciwciała IgG, i barwionych koniugatem przeciwciał kozich z FITC.
Test ELISA jest uważany za bardziej czuły od testów IFA I IPMA. Opisano kilka typów: ELISA typu pośredniego z wykorzystaniem stosunku OD próbki do OD próbki kontrolnej dodatniej (S/P), ELISA typu pośredniego z wykorzystaniem wartości OD, i test ELISA typu blocking. Obecnie dostępnych jest kilka komercyjnych testów ELISA (Ryc. 4). Automatyka produkcji testów ELISA powoduje, że charakteryzuje je niższa zmienność wyników niż pozostałe testy serologiczne. Inne zalety komercyjnych testów ELISA to a) wykrywanie przeciwciał przeciw obu genotypom; b) szybkość; c) możliwość udzielania licencji. Ostatnio test ELISA został zaadaptowana do wykrywania przeciwciał dla PRRSV w płynie ustnym jako metody monitoringu stad.
Ryc. 4. Fotografia płytki testu ELISA IDEXX ELISA X3 pokazująca wyniki dodatnie (niebieskie zabarwienie) i ujemne (brak zabarwienia). Nasilenie zabarwienia zależy od poziomu przeciwciał w surowicy (silniejsze zabarwienie odpowiada wyższemu poziomowi przeciwciał). (Photo courtesy: Dr. David Baum, Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory)
Test SVN jest również uważany za specyficzny lecz badania wykazały, że jego czułość jest niższa niż IFA i ELISA. Niska czułość wynika głównie z faktu późnego i powolnego pojawiania się przeciwciał neutralizujących u zakażonych świń. Test SVN jest stosowany raczej jako narzędzie badawcze ze względu na pracochłonność jego wykonania. Jak w przypadku IFA i IPMA, jego wyniki zależą od poziomu pokrewieństwa antygenowego między szczepem wykorzystanym w teście a szczepem zakażającym świnie.
Interpretacja wyników diagnostyki serologicznej PRRSV
Badanie serologiczne może być przydatne w potwierdzaniu infekcji PRRSV w stadzie. Informacja uzyskana w badaniu jednej próbki jest niewystarczająca dla postawienia rozpoznania PRRS u jednej świni. Przy interpretacji wyniku powinno się wziąć pod uwagę obecność przeciwciał siarowych. Należy również pamiętać, że obecne testy serologiczne nie są w stanie różnicować serokonwersji wywołanej zakażeniem i poszczepiennej. Ponadto, udokumentowano występowanie wyników fałszywie ujemnych nawet w przypadku komercyjnych testów ELISA. Wynik ujemny badania próbek może być interpretowany wielorako: a) świnie nie zostały zakażone; b) świnie zostały zakażone niedawno i jeszcze nie uległy serokonwersji; c) świnie były zakażone wirusem ale utraciły już przeciwciała; i d) wynik był ujemny ze względu na niską czułość testu lub błąd laboratoryjny. Dlatego też przy jednokrotnym badaniu próbek należy zastosować odpowiednie próbobranie. Celem badania jest określenie czy stado zostało zakażone a nie czy poszczególne świnie zostały zakażone.
Zwykle zaleca się badania młodych zwierząt a nie loch. W fermach o cyklu zamkniętym seroprewalencja PRRSV jest na ogół najwyższa u starszych warchlaków i tuczników. Badanie surowic od 10 tuczników jest zwykle wystarczające dla określenia czy stado uległo zakażeniu PRRSV. W systemach typu multi-site, każda faza produkcji stanowi odrębną populację, i w celu określenia wieku infekcji próbki należy pobierać z każdego miejsca produkcji.
Diagnostyka serologiczna zaburzeń w rozrodzie wywołanych zakażeniem PRRSV może być realizowana przez badanie par surowic, lub badaniu zmian w mianie przeciwciał (np. wzrost poziomu przeciwciał) w parach surowic. Lochy mogą ulec zakażeniu 2 lub więcej tygodni przed pojawieniem się objawów klinicznych, w związku z czy wzrost miana przeciwciał może być niewidoczny. Obecność przeciwciał dla PRRSV w płynie płodowym lub we krwi pobranej od martwo urodzonych lub słabych prosiąt przed pobraniem siary również stanowi potwierdzenie wystąpienia zakażenia PRRSV. Ostateczne rozpoznanie PRRS może może być postawione na podstawie interpretacji wyniku badania serologicznego w połączeniu z innymi testami wirusologicznymi.
