Serotypowanie izolatów terenowych Actinobacillus pleuropneumoniae przy użyciu metody PCR

Serotypy Actinobacillus pleuropneumoniae (App) różnią się między sobą poziomem zjadliwości (zależnie od regionu geograficznego). W związku z czym, przy opracowywaniu programu kontroli zakażeń niezbędne jest określenie serotypu z jakim mamy do czynienia. Informacja ta pozwoli nam wybrać szczepionkę odpowiednią dla danej fermy (Gottschalk, 2015). Na podstawie budowy otoczkowego polisacharydu wyróżnia się 18 serotypów App (Bossé et al., 2018a), z czego 1,5,9 i 11 określa się jako najbardziej zjadliwe. W obrębie gatunku wyróżniamy dwa biotypy: szczepy zależne od NAD (dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy) oraz szczepy niezależne od NAD

Standardowo, w celu określenia serotypu, wykonywano badania serologiczne, wykorzystując metody aglutynacji koagulacji, immunodyfuzji, hemaglutynaji pośredniej czy precypitacji pierścieniowej. Problemem przy wykonywaniu tego rodzaju badań jest reakcja krzyżowa pomiędzy niektórymi serotypami (np. 3/6/8 oraz 1/9/11), ponadto potrzebne są specyficzne przeciwciała surowic o wysokich mianach.W ostatnim czasie stwierdzono, że większość szczepów z Wielkiej Brytanii i Irlandii, przyporządkowanych na podstawie badań serologicznych, określono błędnie jako serotyp 3. Prawidłowo powinny być one opisane jako serotyp 8 (O'Neill et al., 2010). Z powodu takich pomyłek opracowano testy molekularne wykorzystujące reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) w celu powielania serotypowo specyficznych sekwencji DNA odpowiedzialnych za produkcję substancji budujących otoczkę (Bossé et al., 2014). Ukierunkowanie badań na serotypowo specyficzne sekwencje DNA umożliwiło opracowanie specyficznego testu wykrywającego serotyp 16 (Bossé et al., 2017), a następnie doprowadziło do odkrycia nowych serotypów- 17 i 18 (Bossé et al., 2018a). Wraz z odkryciem serotypów 16-18 zdecydowano się na stworzenie testu PCR, który umożliwi prawidłowe przyporządkowanie wszystkich znanych serotypów App. Problemem okazały się serotypy 9 i 11, nie ma możliwości zróżnicowania ich metodą PCR, ponieważ loci genów odpowiedzialnych za ekspresję substancji budujących otoczkę są niemal identyczne (Bossé et al., 2018b). Metody serologiczne również nie pozwalają na rozróżnienie tych serotypów (Gottschalk, 2015). Test PCR musi potwierdzić, że dany izolat to App oraz określić przynależność do serotypu. Aby rozpoznać izolat jako App, użyto starterów amplifikujących wybrany odcinek (418 bp) genu apxIV specyficznego dla App (Schaller et al., 1999). Natomiast, z powodu znacznej ilości istniejących serotypów (n=18), niezbędne było opracowanie dwóch testów multipleks PCR (mPCR). Każdy z nich jest zdolny do zróżnicowania wielu serotypów. Test mPCR1 wykrywa serotypy 1-12 oraz 15 (Fot. 1A), natomiast mPCR2 serotypy 13-14 i 16-18 (Fot.2). Jeżeli w teście mPCR1 wykrywana jest jedynie amplifikacja genu apxIV, wykonywany jest test mPCR2.

W przebiegu mPCR2, na podstawie starterów amplifikujących odcinek 1339 genu nadV (gen odpowiadający za niezależność od NAD), można określić również biotyp. Odcinek 1339 amplikonu nadV oznacza się jedynie w szczepach referencyjnych biotypu 2 ( serotypy 13-14). Należy tu wspomnieć, że inne serotypy (np. 2,4,7 i 17) zostały przyporządkowane do biotypu 2, a niektóre szczepy serotypu 13 z Ameryki Północnej do biotypu 1 (Gottschalk, 2015).

Matrycą DNA do testu PCR może być oczyszczone DNA (zarówno pochodzące z hodowli bakteryjnej bądź próbek tkanek), uzyskane przy użyciu komercyjnych zestawów, z gotowanego lizatu bakteryjnego zawierającego całe komórki bakteryjne bądź z kolonii z hodowli płytkowych. Oczyszczone DNA daje najpewniejsze wyniki, w porównaniu do badania PCR z kolonii, które może dać częściowo fałszywie ujemne wyniki. Dzieje się tak w przypadku, gdy kolonie są bardzo lepkie i trudno ulegają lizie. Właśnie taką sytuację pokazuje wynik badania trzech terenowych szczepów należących do serotypu 2. W przebiegu badania PCR z kolonii doszło jedynie do amplifikacji specyficznie serotypowo odcinka, natomiast używając DNA oczyszczonego jako matrycy, zaobserwowano zarówno amplifikację odcinka specyficznego serotypowo oraz odcinka genu apxIV (Zdj.2). Bardzo rzadko zdarza się sytuacja, że nawet oczyszczone DNA jako matryca nie wykaże amplifikacji odcinka genu apxIV (Bossé et al., 2014). W razie takiego problemu, można użyć alternatywnych starterów amplifikujących odcinek genu apxIV (oAPXIV-TSP1/2) w celu potwierdzenia przynależności badanego izolatu do gatunku App (Tegetmeyer et al., 2008). Testy mPCR1 i mPCR2 można wykorzystać do identyfikacji nowych serotypów, tak jak w przypadku serotypów 17 i 18 (Bossé et al., 2018a). Izolaty App, które wytwarzają prążek dla odcinka apxIV bez prążka dla amplikonów specyficznych serotypowo, mogą być potencjalnie nowym serotypem. Aczkolwiek brak serotypowo specyficznego odcinka może być również spowodowany nieprawidłowym dobraniem startera w różnych izolatach bądź z powodu obecności fragmentu zakłócającego locus genu otoczki. Dopiero zsekwencjonowanie całego genomu danego izolatu może potwierdzić, która z tych możliwości jest prawdziwa.

Podsumowując, w przypadku monitoringu zakażeń App, niezmiernie istotna jest wiedza na temat, jaki serotyp App występuje w danym stadzie, czy też w danym kraju. Serotypowanie przy użyciu metod PCR (mPCR1 i mPCR2) to bardzo przydatne narzędzie, które może być wykorzystane w celu identyfikacji zjadliwych serotypów, doboru odpowiedniej szczepionki (komercyjna czy autogeniczna). Dzięki takiej wiedzy możemy również zapobiegać wprowadzeniu zwierząt potencjalnie zakażonych zjadliwymi szczepami App do stad naiwnych. Dodatkowo, metoda ta stwarza możliwość zidentyfikowania potencjalnych, nowych serotypów oraz udoskonalenia dotychczasowej diagnostyki zakażeń App.

Podziękowanie

Badania nad App w laboratorium autora powyższych badań są wspierane przez Brytyjską Radę ds. Badań Biotechnologicznych i Biologicznych.